細胞凍存和復蘇的原理和過程

細胞凍存與復蘇是一種用于長期儲存細胞的技術，其原理和過程分別如下：

細胞凍存的原理

細胞凍存是指將細胞保存在超低溫環境中，暫時停止細胞的代謝活動，使細胞進入“冬眠”狀態的一項技術。一般細胞凍存遵循“慢凍”原則，這是因為在降溫過程中，細胞器會脫水，細胞內可溶性物質濃度增加，并形成冰晶。緩慢冷凍的過程可以逐漸使細胞脫水，以防止細胞內形成大冰晶，因為大冰晶可能導致細胞膜和細胞器的損傷和破裂。同時，常使用二甲基亞砜（DMSO）或甘油作為細胞冷凍保護劑，其應用原理在于：一方面可以提高細胞膜對水的通透性，使細胞內水分滲出到細胞外，在一定程度上可以減少胞內冰晶的產生；另一方面可以使冰點降低，延緩整個冷凍過程。

細胞凍存的過程

細胞凍存的一般過程如下：

準備細胞：選擇對數生長期的細胞進行凍存，確保細胞狀態良好且無污染。同時，根據細胞類型控制好細胞的密度。

配制凍存液：根據實驗習慣配制凍存液，一般包含培養基、血清和DMSO等成分。配制完成后，需嚴格避光保存。

分裝細胞：將細胞懸液與凍存液混合均勻后，分裝入凍存管中，每管1~1.5ml。同時，在凍存管上標明細胞的名稱、凍存時間及操作者等信息。

降溫凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1-2℃/min；當溫度達到-25℃以下時，可增至-5℃-10℃/min；直到-100℃時，可迅速浸入液氮中。此外，也可以采取手動梯度降溫法或程序降溫盒法進行凍存。但需要注意的是，手動梯度降溫不易把控，溫度不穩定，可能降低細胞存活率，因此不太建議使用。

細胞復蘇的原理

細胞復蘇是指將凍存在液氮或超低溫冰箱中的細胞解凍之后重新培養，使細胞恢復生長的過程。其原理在于當細胞恢復到常溫狀態時，其形態結構保持正常，生化反應即刻恢復。細胞復蘇過程升溫要快，原則是“慢凍快融”，以防止在解凍過程中水分進入細胞，形成冰晶，影響細胞存活。

細胞復蘇的過程

細胞復蘇的一般過程如下：

取出凍存管：從液氮容器中或超低溫冰箱中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動，促使其盡快融化。需要注意的是，應避免水浴時間過長或溫度過高，以減少DMSO對細胞的毒性作用。

處理細胞懸液：從37℃水浴中取出凍存管后，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加入離心管中，并滴加10倍以上的培養液，混勻。

離心棄上清：對細胞懸液進行離心處理，棄去上清液。

重懸細胞：加入含10%小牛血清的培養液以重懸細胞。進行計數后，調整細胞密度，然后將其接種到培養瓶中。

靜置培養：將接種后的培養瓶置于37℃培養箱中靜置培養。次日更換一次培養液后繼續進行培養。

注意事項

在細胞凍存和復蘇過程中，需要注意以下事項：

確保細胞狀態良好：在凍存之前，確保細胞具有良好的形態且無污染。

選擇適合的凍存液：根據細胞類型選擇合適的凍存液，并按照相應的操作規程進行細胞的凍存和復蘇。

控制細胞密度：凍存時要控制好細胞的密度，避免過低或過高影響凍存效果。復蘇后也需要根據細胞類型和生長情況進行適當的調整。

合理存放：細胞長期存放在-80℃冰箱時，建議靠冰箱內側放置樣本，避免開關冰箱導致溫度不穩定影響細胞保存效果。

檢測存活率：細胞凍存后應取出一管進行復蘇，并檢測細胞的存活率。為穩妥起見，可在細胞凍存半年后進行復蘇培養并觀察細胞生長情況。

綜上所述，細胞凍存與復蘇的原理和過程都至關重要，正確的操作方法和注意事項可以確保細胞的存活率和生長狀態。