PCR擴增過程主要三個步驟

?PCR擴增?（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種在體外擴增特定DNA片段的技術(shù)。其基本過程包括三個主要步驟：變性、退火和延伸，這三個步驟在一個循環(huán)中重復(fù)多次，從而實現(xiàn)DNA的指數(shù)級擴增。

變性

溫度：通常將反應(yīng)體系加熱至 94-98°C。

目的：高溫使雙鏈 DNA 的氫鍵斷裂，兩條鏈解開成為單鏈，以便引物能夠與模板鏈結(jié)合。

時間：一般持續(xù) 15-30 秒，以確保所有的雙鏈 DNA 都完全解鏈。

退火

溫度：溫度降低至 50-65°C。

目的：引物與單鏈 DNA 模板的互補序列特異性結(jié)合，形成 DNA 模板 - 引物復(fù)合物，為后續(xù)的 DNA 合成提供起始位點。退火溫度的設(shè)定取決于引物的序列和長度等因素，一般根據(jù)引物的 Tm 值進行優(yōu)化選擇1。

時間：持續(xù) 15-30 秒，讓引物有足夠的時間與模板 DNA 結(jié)合。

延伸

溫度：提升至 72°C 左右。

目的：在熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶（如 Taq 聚合酶）的作用下，以 dNTP 為原料，按照堿基互補配對原則，從引物的 3’端開始，沿模板鏈合成新的 DNA 鏈。

時間：根據(jù)目標(biāo) DNA 片段的長度而定，通常每 1kb 的 DNA 需要 1 分鐘左右。

這三個階段構(gòu)成了一個 PCR 循環(huán)，一個典型的 PCR 實驗可能包含 25-40 個這樣的循環(huán)，以獲得足夠量的目標(biāo) DNA。在完成設(shè)定的循環(huán)次數(shù)后，一般還會設(shè)置一個最后的延伸步驟，如在 72°C 下延伸 5-10 分鐘，以確保所有 DNA 片段都被完全合成。